Fluorescences mikroskopija: principi metodes

Absorbcijas un re-gaismas izstarošanai turpmāku neorganisko un organisko šķidrumu ir rezultāts fosforescence vai fluorescences. Starpība starp parādībām ir ilgums ir intervālā starp absorbcijas un emisijas gaismas plūsmu. Kad fluorescences šiem procesiem notiek gandrīz vienlaicīgi, bet fosforescence - ar nelielu nokavēšanos.

vēsturiskā informācija

1852.gadā, britu zinātnieks Stokes, pirmo reizi tika aprakstīta fluorescenci. Viņš ieviesa jaunu terminu, kā rezultātā eksperimentiem ar Fluoršpata, kuras izstaro sarkanu gaismu ultravioletajā gaismā. Stokes atzīmēja interesantu parādību. Tas ir konstatēts, ka viļņa garums fluorescējošā starojuma vienmēr ir lielāks nekā plūsmas ierosināšanas gaismas.

Lai apstiprinātu hipotēzi 19. gadsimtā ir bijuši daudzi eksperimenti. Tie liecina, ka dažādi paraugi fluorescē reibumā ultravioleto gaismu. Starp materiāliem, cita starpā, bijuši kristāliem, sveķus, minerālvielas, hlorofilu, neapstrādāta narkotikas, neorganiskie savienojumi, vitamīniem, eļļu. Tiešais izmantošana krāsvielu Bioloģisko testu sākās tikai 1930. gadā

Fluorescences mikroskopija: apraksts

Daži no izmantoto materiālu pirmajā pusē 20.gadsimta pētījumos uzrādīja augstu specifiskumu. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Pateicoties sniegumu, ko nevar sasniegt ar kontrastējošas metodes, metode fluorescences mikroskopijas ir kļuvusi par svarīgu instrumentu biomedicīnas un bioloģisko izpēti. Tāpat tika iegūti nozīmīgi rezultāti, un materiāliem.

? Kādas priekšrocības metode fluorescences mikroskopijas? jaunu materiālu izmantošana ir kļuvis iespējams, un izvēle ļoti specifisks šūnu mikroskopisku komponentiem. Fluorescences mikroskopijas var atklāt single molekulas. Dažādas krāsvielu ļauj identificēt vairākiem objektiem vienlaicīgi. Neskatoties uz difrakcijas ierobežojumu iekārtas, kas, savukārt, ir atkarīgs no konkrētā parauga īpašībām ierobežoto telpisko izšķirtspēju, identifikācijas molekulu zem šī līmeņa, ir diezgan iespējams. Dažādas paraugi pēc apstarošanas izstāžu autofluorescences. Šī parādība tiek plaši izmantots petrology, botānikā, pusvadītāju rūpniecībā.

funkcijas

Pētījums dzīvnieku audus vai patogēnus nereti sarežģītas vai pārāk vājas vai ļoti stipras nekonkrēts autofluorescences. Taču vērtība pētījumos iegūst ievešana materiālajām sastāvdaļām satraukti konkrētā viļņa garuma un izstaro nepieciešamo gaismas plūsmas intensitāti. Fluorhromiem darbojas kā krāsvielas, kas spēj patstāvīgi pievienoti struktūrām (redzamiem vai neredzamiem). Tādējādi tie ir augsts selektivitāti uz mērķi, un kvantu daudzums.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Fluorescences mikroskopija ir plaši izmantota kopš Advent dabas un sintētisko krāsvielu. Viņi piederēja noteiktas intensitātes profili emisiju un uzbudinājuma un paredzēti konkrētu bioloģiskajiem mērķiem.

Identifikācija atsevišķu molekulu

Bieži vien, ideālos apstākļos, jūs varat reģistrēt atsevišķu elementu mirdzumu. Lai to izdarītu, cita starpā, ir nepieciešams nodrošināt pietiekami zemu trokšņa detektora un optisko fona. Fluoresceīna molekula neveiksmes dēļ fotobalināšanas var izstarot līdz 300 tūkst. Fotonus. Pie 20% savākšanas procesa efektivitāti un var reģistrēt tos daudzumā apmēram 60 tūkstoši.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. Fluorescences mikroskopija pamatojoties uz lavīnfotodiode vai elektroniskā reizināšanu, ļāva zinātniekiem novērot uzvedību atsevišķu molekulu ar otro, un dažos gadījumos pat minūtes.

sarežģītība

Galvenais jautājums, par labu apspiešanu optiskā trokšņu fona. Sakarā ar to, ka daudzi no izmantoto materiālu dizainā filtru un lēcām piemīt dažas autofluorescences, centieni zinātnieku sākumposmā tika orientēta uz ražošanu komponentu, kam ir zems fluorescenci. Tomēr turpmākie eksperimenti ir noveduši pie jauniem secinājumiem. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. Jo īpaši, tika konstatēts, ka fluorescences mikroskopijas, pamatojoties uz kopējo iekšējo pārdomu, tas ļauj sasniegt zemu fonu un augstas intensitātes uzbudinājums gaismas.

mehānisms

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Par fluorescences mikroskopijas principiem, pamatojoties uz kopējo iekšējo pārdomu ir izmantot gaistošs viļņa vai gaistoši. Tas notiek uz robežas starp medijiem ar dažādiem refrakcijas koeficientiem. Tādā gadījumā gaismas stars iet caur prizmu. Tas ir liels laušanas koeficienta parametru.

Prizmu blakus ūdens šķīdums vai stikla ar zemu parametru. Ja ar gaismu, kas vērsta uz to leņķī, kas ir vairāk kritiski, gaismas ir pilnīgi atspoguļots no interfeisu. Šī parādība, savukārt, izraisa nonpropagating viļņiem. Citiem vārdiem sakot, radītais elektromagnētiskais lauks, kas iespiežas barotnē ar zemāku refrakcijas koeficienta parametru, lai attālums ir mazāks par 200 nanometriem.

Gaistošs vilnis gaismas intensitāte būtu pietiekama, lai satraukt fluoroforu. Tomēr, jo tā ir ļoti maza dziļumu, tā apjoms būs ļoti mazs. Rezultāts ir zema līmeņa fona.

modifikācija

Fluorescences mikroskopija ir balstīta uz kopējo iekšējo pārdomu, var īstenot ar epi-apgaismojumu. Tas prasa lēcas ar augstu skaitlisko apertūru (vismaz 1,4, bet tas ir vēlams, ka tā sasniedza 1.45-1.6), un daļēji izgaismota lauka aparātu. Pēdējais tiek panākta ar nelielu vietas izmēru. Lai panāktu lielāku vienveidību, izmantojot plānas gredzenu, kuru bloķē daļu no strauta. Par kritisko leņķi, pēc kura pastāv pavisam pārdomas, mums ir nepieciešams augsta līmeņa refrakcijas iegremdējot vidē lēcu un vāka glāzi mikroskopa.