Molecular ģenētisko pētījumu metode

Lai izpētītu un identificēt variantus DNS struktūru, ko izmanto molekulāro ģenētisko metodi. Katram DNS reģionu, kas pēta šajā reģionā hromosomu, kā arī gēnu vai alēles, metodes atšķiras. Pamatā katram molekulārā ģenētisko metodi satur daži vai citu manipulāciju, RNS un DNS. Visas šīs metodes ir raksturīgs milzīgs sarežģītības, bez laboratorijas apstākļos nav iespējams veikt, un darbinieki ir augsti kvalificēti. Šis darbs tiek veikts vairākos posmos.

posmi

Pirmkārt, RNS vai DNS paraugi tiks ražoti. Šeit, molekulārā ģenētisko metodi var izmantot, lai praktiski jebkura materiāla: pilienu asinis, leikocītu, fibroblastu kultūru, gļotādas (izgrebj), pat matu folikulu, - DNS var iegūt no jebkuras paraugā. Tā ir piemērota, lai izmantotu jebkuru molekulārās ģenētiskās metodes un to dažādas iespējas un jau sen izolēta DNS tiek glabāta frozen. Otrajā posmā ir veltīta uzkrāšanās vēlamo fragmentu (pastiprināšanas) DNS, kā tas palīdz nodrošināt polimerāzes ķēdes reakciju in vitro (in vitro neiesaistot dzīvo organismu). Kā rezultātā, kas izvēlēti DNS fragments reizina ar šīs ķēdes reakciju, kā arī summu no DNS palielinās burtiski miljoniem reižu.

Trešais solis molekulu ģenētisko pētījumu metodēm tiek pieņemts, kas reizināts DNS ierobežojumu (šīs nepilnības, plīsumi vai griešanai). Ierobežojums ar elektroforēzes veikta uz poliakrilamīdu vai agarozes gelā. Šī molekulārā ģenētiskā pētīšanas metodē DNS fragmenta ļauj ikvienam ieņemt noteiktu pozīciju gelu. Pēc tam, gelu, kas ārstēti ar etīdija bromīdu, kas spēj saistīties ar DNS, apstarošana ar ultravioleto gaismu, tad tas ir iespējams novērot luminiscences porcijas. Molekulāri ģenētiskā diagnostikas metodes ir dažādas, un daudz, bet pirmie divi soļi ir kopīgi visiem. Bet, lai noteiktu DNS fragmentus, želeja var krāsot, un daudzas citas esošās metodes.

suga

Vistaisnākajā un izplatītākie metodēm, lai noteiktu mikobaktērijas var ietvert augstāk molekulāro ģenētiskā DNS mācīšanās metodi. Tās būtība ir tāda, ka, lai noteiktu skenēšanas ķēdes materiālu īpašo fragmentu DNS patogēnu. Molekulārā ģenētiskās diagnostikas metodes vēl nav nodrošina efektīvu atpazīt šādas slimības kā tuberkuloze. Izmantojot polimerāzes ķēdes reakciju (PĶR), jūs varat būt pārliecināti, ka sākotnējais DNS palielinās eksemplāru skaitu miljons reižu, tas ir, būs pastiprinājums, un tas parādīs rezultātus. Jutība līmenis ir ļoti augsts - vairāk nekā deviņdesmit pieci procenti, kas ir galvenā šīs metodes priekšrocība.

Molekulu-ģenētisko metožu pētījumi par efektivitātes ražas tiražēts pārējais burtiski dubultojās, jo šajā gadījumā sastādīšanu paraugs īpašs oligonukleotīds secība palielinājās līdz simts un sešas reizes. Pat kultūra diagnoze tuberkulozes elpošanas sistēmas ievērojami samazināt tās jutīgumu. Tas ir iemesls, kāpēc mūsdienu medicīna ir balstīta uz molekulāriem ģenētiskajām metodēm diagnosticētu tuberkulozi. Aprakstītās metode ir efektīva, jo īpaši, saskaroties ar patogēniem augstas antigēnu mainību, nosaka, ka citā veidā ir daudz grūtāk - prasa īpašas barotnes un kultivēt ilgu laiku. Bioķīmiskās un molekulārās ģenētikas metodēm ražot ļoti atšķirīga ietekme uz rezultātiem.

diagnoze no tuberkulozes

Marshall PCR diagnoze no tuberkulozes visbiežāk izmanto DNS secības, kas ir raksturīgi visiem četru veidu slimības. Lai sasniegtu šo mērķi, bieži izmanto grunts, kas noteiktu secība IS elementus (IS-986, IS-6110), jo šie elementi raksturo tālu migrējošo sugu Mycobacterium tuberculosis un vienmēr ir klāt vairākas kopijas genomā. Arī DNS izdalīšana var veikt no tīrkultūrām un klīniskās (gļotām pacientu), izmantojot jebkuru citu piemērotu metodi. Piemēram, tur Boom metode, kur līzes buferšķīdumu izmanto, pamatojoties uz guanidīna tiocianātu un silīcija dioksīda, kā nesošās DNS. Pacientu, kas atšķiras slikta bakterioloģiskie katru gadu pieaug, un līdz ar to klīniskajā praksē ir izveidota pilnīgi atšķirīgu līmeni organizācijas numurs: molekulārā-ģenētisko metodi pētot DNS ir spēlē nozīmīgu lomu diagnozes.

Tomēr jāatzīst, ka tas nav bez trūkumiem. PĶR metode ir izmantot bieži rada ļoti daudz viltus pozitīvus rezultātus, un iemesls ir ne tikai tehniskas kļūdas, bet arī iezīmes pašas metodes. Turklāt, izmantojot šo metodi diagnozes noteikšanai dzīvotspēju mikobaktēriju, kas ir noteiktas, tas ir vienkārši neiespējami. Bet tas trūkums nav svarīgākais. Molekulārās ģenētikas metodēm PCR diagnostikas rada risku piesārņojuma mikobakteriālu DNS. Sertifikācijas prasības attiecībā uz šī iemesla dēļ, ka PCR laboratorijām paredzētas tikai grūti, viņi prasa trīs atsevišķas telpas. PCR tehnoloģija ir moderna un ļoti sarežģīts, tas prasa izmantot atbilstošu aprīkojumu un augsti apmācīti darbinieki.

bacterioscopy

Ja diagnostikas analīzes rezultāti ir jāsalīdzina ar citiem datiem: klīnisko pārbaudi, radiogrāfijas, uztriepes mikroskopija, kultūru un pat atbildot uz īpašu attieksmi, ir ļoti svarīgi. Šajā sērijā, PCR pētījumi ir tikai viena no sastāvdaļām. Noteikt patogēns agrīnā diagnostikā var būt vienkāršākais un ātrākais metodes - bakterioloģiskie.

Tur tiek izmantota gaismas mikroskopu (krāsvielas Ziehl-Neelsen) un fluorescējošās (krāsviela fluorhromiem). Priekšrocība ir ātrums uztriepes rezultātiem. Bet tās trūkums tiek pamatoti uzskatīts par ierobežotas spējas zemā jutību. Tomēr šī metode ir dota PVO ieteikumu kā visekonomiskākais un zemes, lai konstatētu tuberkulozes pacientus. Atklāšana mikobaktēriju bakterioloģisko metodi ir paredzēšanas vērtību un paredzamo kvantitatīvi baktēriju izdalīšanos. Daudz vairāk pārliecināti ar to tikt galā molekulārās ģenētiskās izpētes metodēm tuberkulozi.

kultūras

Labāka atklāšana mikobaktēriju atzīst kultūras studijas. Sēšanas patoloģiskais materiāls tas tiek veikts uz olu vidē: Mordovsky, Finn II, LJ, un tamlīdzīgi. Kritēriji rezistences mikobaktēriju pret medikamentu un netiešiem pierādījumiem efektivitāti vairāku mikobaktēriju un to kolonijām in vitro, ja izmantotās metodes pētniecības kultūru. Lai palielinātu procentuālo izolāciju mikobaktēriju potējot patoloģiskā materiāla notika vairākos vidēs.

Tikšanās vajadzībām daudziem kultūras, patogēnu, tostarp dotāciju un šķidrumiem. Izmanto šo sistēmu un automatizēto mērīšanas tipa VANTES izaugsmi. Kultūraugi jātur inkubācijas līdz septiņas līdz astoņas nedēļas. Pa šo laiku raža ar trūkumu pieaugumu var uzskatīt par negatīvu. Visefektīvākais veids, lai atklātu Mycobacterium tuberculosis apsvērt bioloģiskos paraugus: diagnostikas materiāls inficē jūrascūciņas, kas ir ļoti uzņēmīgi pret TB.

Daži skaitļi

Interesants studiju joma, kuru atklāja PCR diagnostikas bija izpētīt M. tuberculosis - latento infekciju. Mūsdienu koncepcija TB infekcijas liecina, ka no simts cilvēkiem, kuri bijuši saskarē ar M. tuberculosis, deviņdesmit labi var būt inficēti, bet tikai desmit no tiem ir aktīvi slimība tiek izstrādāta. Citi ir TB imunitāti, un tāpēc, ka deviņdesmit procentos gadījumu infekcija saglabājas latentā. Atklāt modeli tas ir palīdzējis ar molekulāro ģenētisko metodi.

Ģenētiķi saka, ka piecdesmit pieci procenti no tiem, kura kultūras patoloģisks materiāls bija negatīvs, un astoņdesmit procenti ir inficēti ar M. tuberculosis cilvēkiem, bet plūst bez radiogrāfijas izpausmes slimības, saņēma PCR pozitīvas atbildes. Tā ir ģenētiska diagnostikas metode palīdzēja apzināt pacientus riskam, ko PCR pētījumiem, ar to analīzēm (mikroskopija un kultūras) rezultāti bija negatīvi, un subklīnisku infekciju M. tuberkuloze bija klāt.

Mūsdienu pētījumi

Krievijas Federācija un bakterioloģiskās laboratorijas izmantot paātrinātu metodi absolūto koncentrāciju: nitrātu reduktāzes aktivitāte, ko Griess reaģentu pārbaudīto mikobaktēriju. Anti-TB centri izmanto metodi, kas ļauj noteikt zāļu rezistenci. Šis sēšanas in šķidrā barotnē, kur automatizēta radiometrisko un fluorescējošo uzskaites sistēmas augšanu mikobaktēriju. Šāda analīze tiek veikta ātri - līdz pat divām nedēļām.

Pašlaik jaunas metodes tiek izstrādātas: narkotiku pretestība mikobaktēriju mēra pie genotipa līmenī. Pētījums par molekulāro mehānismu rezistences gēnu, un liecina klātbūtni mikobaktēriju. Šie gēni ir saistīti ar izturību pret dažiem medikamentiem. Piemēram, kasa gēniem, inhA, katG izturīgs pret izoniazīdu, rpoB gēna - rifampicīnu 16Sp RNS gēnu un rpsL - streptomicīnu, emb1 - uz ethambutol, Gyra - fluorhinolonu un tā tālāk.

mutācijas

Mūsdienu diagnoze ir ievērojami palielinājusi molekulāro-ģenētisko līmeņa metodi pētot DNS un atļauts veikt liela mēroga pētījumus mutāciju visā to spektrā. Tagad mēs zinām, ka visbiežāk mutācijas 516, 526 un 531 kodonu rpoB gēnu, un noteica izturību pret dažādiem medikamentiem. Ir vesela virkne metožu rakstīt mikobaktēriju izmanto ne tikai tradicionālās metodes - bioķīmisko, bioloģisko un kultūras, bet arī plaši izmanto modernās molekulārās ģenētiskās metodes. Jau pastāv adekvāti un sniedz pareizu diagnozes metodi atklāšanai monogenic slimībām. Tie ir balstīti uz DNS pētījumiem precīzu jomā konkrēts gēns. Tas parasti ir sarežģīts process, laikietilpīgs un dārgs, bet dati, kas tiek nodrošināts ar molekulāro ģenētiskās analīzes, ir daudz precīzāka un informatīvi nekā datiem visām citām analīzēm.

Tas jau sen ir zināms, ka DNS nemainās visu dzīvi organisma, ka tā ir jebkurā kodolainajās šūnu odnakova, un tas ļauj veikt analīzi par pilnīgi visu ķermeņa šūnās, jebkurā stadijā attīstību savstarpēji. Bojātā gēns var noteikt, pirms parādījās pirmie simptomi uz pilna mēroga klīniskās slimības, kā arī veseliem heterozigotām cilvēkiem, bet kam mutācija gēnā. Molekulārā ģenētiskā iedzimts slimības diagnostikas metodes ļauj atklāt savas (tiešu pieeju, ir DNS diagnostiku), kā arī, lai analizētu segregāciju slimības ģimenes ar marķieris loci DNS (ģenētisko polimorfismu), kas ir cieši saistīta ar bojātu gēnu (ti, netiešā pieeja no DNS diagnostiku). Tieši vai netieši - jebkuras DNS diagnostika ir balstīta uz metodēm identificētu stingri noteikts daļu no cilvēka DNS.

tiešās metodes

Tiešās metodes DNS diagnozes ir kad vaininieks gēns iedzimta slimība ir zināms, kā labi zināms, un no tās mutāciju tipi. Piemēram, piemērots tiešās metodes daudzām slimībām. Tas Hantingtona horeja (paplašinājums CTG-atkārtojas), fenilketonūrija (R408W), cistiskās fibrozes (delF508, galvenās mutācijas) un tamlīdzīgi. Galvenā priekšrocība tiešās metodes ir pilnībā piederošs diagnostikas precizitāti, un nav nepieciešams veikt DNS analīzi pārējo ģimeni. Ja mutācijas attiecīgajā gēna atrasts, tas ļauj precīzi apstiprināt diagnozi iedzimtību, genotipa noteikšanu par pārējo apgrūtināti ģimeni.

Vēl viens tiešā diagnozes priekšrocība tiek uzskatīts noteikt heterozigotiem pārvadātājs slikti mutāciju no radiem un vecākiem, kuri miruši no slimības. Tas īpaši attiecas uz slimības autosomāli recesīvo. Trūkumi tiešās metodes, ir arī pieejama. Lai pieteiktos, Jums ir jāzina precīzi lokalizēt neparasts gēnu, eksona-INTRON struktūru tās spektra un tās mutāciju. Ne visi monogenic slimības šodien saņēmuši šādu informāciju. Informētības tiešās metodes nevar uzskatīt par pilnīgu, jo viens un tas pats gēns var būt liels patoloģiska mutācijas skaits, kas izraisa attīstību iedzimtu slimību.

netiešās metodes

Netiešās metodes DNS diagnostikas tiek izmantotas vispār, citos gadījumos, ja nav identificēts bojāts gēns, bet tikai hromosomās, vai arī, ja līnija diagnoze nedeva rezultātu (tas notiek, ja gēnu komplekss molekulārā organizācija vai lielā mērā, ja ir daudz patoloģiskās mutācijas). Netiešās metodes veica segregācija analīzi polimorfs marķieru allelic ģimenē. Markers atrodami tajā pašā hromosomās reģionā vai lokusā ir cieši saistīta ar slimību un pārstāvēt svītrojumus vai ievietošanu, pārmiju aizvietotājus, atkārtojas, un to polimorfisms ir saistīts ar atšķirīgu daudzumu šūnu blokā.

Lielākā daļa ērta netiešo diagnozes uzskatīts microsatellite un minisatellite polimorfismu, kas tiek plaši izplatīti cilvēka genomā. to vērtība izteikta augstu informācijas saturu, ja kaitējums ģenētisko attālumu starp marķieri un gēnu nav pārāk liels. Pēdējā gadījumā novērtējums precizitāti nosaka lielā mērā biežumu rekombinācijas starp polimorfs marķieri un bojājumiem. Netiešās diagnostikas metodes sniedz arī obligātu iepriekšēju soli alēles frekvencēm analizēto populācijas pētījumā starp pacientiem un pārvadātāju mutāciju, kā arī nepieciešamību noteikt varbūtību krustmijas nonequilibrium un pielipšanas marķieriem un mutantu alēles.

citas metodes

Īsi segmenti RNS vai DNS, kā arī viena gēna vizualizēta ar mikroskopisko izpēti, nevar būt, tāpēc, lai identificētu mutācijas, kas nepieciešami molekulāro ģenētiskā diagnostika. Tur ir "Cilvēka genoma projekts", kā arī citi uzlabojumi, kas molekulārās ģenētikas ievērojami paplašināja iespēju diagnozes iedzimto slimību - gan pirms, gan pēcdzemdību. Šīs metodes var nodrošināt agrīnu diagnostiku un veikt paredzēšanas polinepiesātinātiem un monogenic slimību, kura debija notiek pieaugušajiem. Diemžēl, sakarā ar tehniskajām iespējām molekulārā ģenētiskos pētījumus, dažreiz ārpus ētikas robežām, kas noteiktas attiecībā uz mantojumu, it īpaši, ja diagnoze ir pusaudžu vecumā un bērnībā.

Strukturālās un skaitliskās hromosomu anomālijas ir visbiežāk cēloņi slimības un vēzi, un daudzi anomālijas. Hromosomu aberācijas nepieciešams identificēt, kas ir svarīgi, lai ģimenes konsultāciju - novērtēt prognozi, kā arī reproduktīvās riskam nākotnē grūtniecību. Hromosomu analīze ir "zelta standarts" ir ģenētiskā diagnostika, bet tas ir ierobežots. Tikai metodes molekulāro ģenētiskās analīzes var darīt vairāk, jo tur izmanto klonēšanas tehnoloģiju balstītu dienasgaismas uzlīmes, kas spēj to augstas jutības identificēt smalks hromosomu izmaiņas, kas nav iespējams atklāt klasisko citoģenētiskās studijas. Šīs metodes arvien paplašinās mūsu diagnostikas spējas, kad pārbaudīja, bērni ar attīstības traucējumiem, garīgās attīstības traucējumiem, ar daudzām citām iedzimtām slimībām.

secinājumi

Tas ir ļoti svarīgi, lai cilvēcei bija gēnu struktūru un funkcijas zināšanu, veidi mainīgums, spēja noteikt iedzimtas slimības, kas radušās saistībā ar attīstību molekulārās ģenētikas. tās metodes ir vērstas uz pētījumu DNS molekulas - un tad, kad tas ir normāli, un, ja tā ir bojāta. Preparation of nukleotīdi (DNS) dezoksiribonukleīnskābes sekvences stiepjas pa posmiem no saņemšanas paraugus, lai identificētu atsevišķus fragmentus. Izolēšana no genoma DNS no šūnām, ierobežojums (negants), amplifikācijas (klonēšanas), elektroforēzi no fragmentiem (atdalot to elektrisko lādiņu un molekulmasa ar agarozes gela). Identificēšana konkrētiem fragmentiem, kas atrodas uz virsmas diskrētu svītru.

Pēc tam nokļūst akts īpašiem filtriem, caur kuru ved ceļš, un katrs fragments hibridizāciju ar klonēto DNS fragmenti vai sintētisko radioaktīvu zondēm ir kontrole, kas ir vienāds ar katra testa parauga. Ja jūs mainīt pozīciju vai tā garumu, salīdzinot ar zondi, ja jauns fragments vai pazuda - tas viss liecina, ka analizējamais gēns ir veikta pārstrukturēšanai nukleotīdu sekvenci. Ir astoņi pamata metodes molekulāro ģenētisko pētījumu: secību (noteikšana DNS sekvences), polimerāzes ķēdes reakcijas (skaita pieaugums sekvenču), sagatavošana praimeru zināmajiem gēnu, DNS klonēšanu, rekombinanto molekulu izcelsmes proteīnu sakarā ar rekombinanto molekulām, veidojot komplektu (vākšana bibliotēka) klonēti fragmentus, kas tika iegūti, izmantojot ierobežojumu.